Development of molecular-based techniques for the detection, identification and quantification of food-borne pathogens

La presencia de microorganismos patógenos en alimentos es uno de los problemas esenciales en salud pública, y las enfermedades producidas por los mismos es una de las causas más importantes de enfermedad. Por tanto, la aplicación de controles microbiológicos dentro de los programas de aseguramiento de la calidad es una premisa para minimizar el riesgo de infección de los consumidores. Los métodos microbiológicos clásicos requieren, en general, el uso de pre-enriquecimientos no-selectivos, enriquecimientos selectivos, aislamiento en medios selectivos y la confirmación posterior usando pruebas basadas en la morfología, bioquímica y serología propias de cada uno de los microorganismos objeto de estudio. Por lo tanto, estos métodos son laboriosos, requieren un largo proceso para obtener resultados definitivos y, además, no siempre pueden realizarse. Para solucionar estos inconvenientes se han desarrollado diversas metodologías alternativas para la detección identificación y cuantificación de microorganismos patógenos de origen alimentario, entre las que destacan los métodos inmunológicos y moleculares. En esta última categoría, la técnica basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha convertido en la técnica diagnóstica más popular en microbiología, y recientemente, la introducción de una mejora de ésta, la PCR a tiempo real, ha producido una segunda revolución en la metodología diagnóstica molecular, como pude observarse por el número creciente de publicaciones científicas y la aparición continua de nuevos kits comerciales. La PCR a tiempo real es una técnica altamente sensible -detección de hasta una molécula- que permite la cuantificación exacta de secuencias de ADN específicas de microorganismos patógenos de origen alimentario. Además, otras ventajas que favorecen su implantación potencial en laboratorios de análisis de alimentos son su rapidez, sencillez y el formato en tubo cerrado que puede evitar contaminaciones post-PCR y favorece la automatización y un alto rendimiento. En este trabajo se han desarrollado técnicas moleculares (PCR y NASBA) sensibles y fiables para la detección, identificación y cuantificación de bacterias patogénicas de origen alimentario (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis y Salmonella spp.). En concreto, se han diseñado y optimizado métodos basados en la técnica de PCR a tiempo real para cada uno de estos agentes: L. monocytogenes, L. innocua, Listeria spp. M. avium subsp. paratuberculosis, y también se ha optimizado y evaluado en diferentes centros un método previamente desarrollado para Salmonella spp. Además, se ha diseñado y optimizado un método basado en la técnica NASBA para la detección específica de M. avium subsp. paratuberculosis. También se evaluó la aplicación potencial de la técnica NASBA para la detección específica de formas viables de este microorganismo. Todos los métodos presentaron una especificidad del 100 % con una sensibilidad adecuada para su aplicación potencial a muestras reales de alimentos. Además, se han desarrollado y evaluado procedimientos de preparación de las muestras en productos cárnicos, productos pesqueros, leche y agua. De esta manera se han desarrollado métodos basados en la PCR a tiempo real totalmente específicos y altamente sensibles para la determinación cuantitativa de L. monocytogenes en productos cárnicos y en salmón y productos derivados como el salmón ahumado y de M. avium subsp. paratuberculosis en muestras de agua y leche. Además este último método ha sido también aplicado para evaluar la presencia de este microorganismo en el intestino de pacientes con la enfermedad de Crohn's, a partir de biopsias obtenidas de colonoscopia de voluntarios afectados. En conclusión, este estudio presenta ensayos moleculares selectivos y sensibles para la detección de patógenos en alimentos (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis) y para una rápida e inambigua identificación de Salmonella spp. La exactitud relativa de los ensayos ha sido excelente, si se comparan con los métodos microbiológicos de referencia y pueden serusados para la cuantificación de tanto ADN genómico como de suspensiones celulares. Por otro lado, la combinación con tratamientos de preamplificación ha resultado ser de gran eficiencia para el análisis de las bacterias objeto de estudio. Por tanto, pueden constituir una estrategia útil para la detección rápida y sensible de patógenos en alimentos y deberían ser una herramienta adicional al rango de herramientas diagnósticas disponibles para el estudio de patógenos de origen alimentario.

Els remences de l'Almoina del Pa de la Seu de Girona (segles XIV i XV)

L'objectiu d'aquesta tesi és estudiar el funcionament real de la servitud catalana medieval. Per això s'estudien els homenatges i els cobraments dels mals usos rebuts i aplicats per l'Almoina del Pa de la Seu de Girona sobre els seus remences al llarg dels segles XIV i XV i, més concretament, entre 1331 i 1458. Aquestes dates han estat determinades per la documentació generada per l'esmentada institució benèfica. El primer llibre de comptes conservat és de l'any 1331. En aquests llibres de comptes els pabordes encarregats de gestionar l'Almoina hi consignaven tots els seus ingressos i totes les despeses. La data final també ha estat fixada per la documentació, perquè a partir d'aquest moment deixem de trobar constància escrita del pagament dels mals usos i de la prestació d'homenatges. La importància dels mals usos, és a dir, aquells pagaments que gravaven als serfs pel fet de ser-ho, a la Catalunya de la baixa edat mitjana és una qüestió fora de discussió. Bona part dels historiadors -Hinojosa, Vicens Vives, Freedman, etc.- atribueixen als mals usos, als homenatges i a la seva continuada exigència els dos alçaments remences contra les senyories feudals a partir de l'any 1462. Segons aquestes hipòtesis, la lluita per suprimir els mals usos i aconseguir la llibertat individual és la raó de les guerres remences de finals del segle XV. Com és sabut van quedar resoltes amb la Sentència Arbitral de Guadalupe, dictada pel rei Ferran II, que va suprimir definitivament la servitud de les terres catalanes. Malgrat la importància que els historiadors han concedit a l'existència dels mals usos i, sobretot, a la manca de llibertat dels remences, no hi ha estudis sistemàtics sobre la seva aplicació a la pràctica. Per això, l'objectiu d'aquesta tesi és estudiar tots els mals usos i tots els homenatges aplicats i rebuts per una sola senyoria -l'Almoina del Pa de la Seu de Girona-, els remences de la qual van participar activament en ambdues guerres i que és representativa, sense cap mena de dubte, del que succeïa en la diòcesi gironina. A més a més, cal assenyalar que l'estudi comprèn un període de temps que inclou circumstàncies tan cabdals com la pesta negra i la resta de catàstrofes del segle XIV i el segle XV fins a la primera guerra remença. Com és sabut, els remences catalans estaven sotmesos a sis mals usos: la redempció de persones (mitjançant la qual aconseguien la seva llibertat), les firmes d'espoli forçades (que havien de pagar quan es casaven en determinades circumstàncies), la intèstia i l'eixòrquia (que gravaven la mort intestada i sense descendents), l'àrsia (que penalitzava la crema accidental del mas o la masada) i la cugúcia (exigida a les dones considerades adúlteres). Els remences confirmaven la seva dependència d'una senyoria en els corresponents homenatges o reconeixements de domini que havien de prestar quan n'eren requerits. Aquesta tesi consta de deu capítols a més d'una introducció (o primer capítol) i d'unes conclusions. El segon capítol és dedicat a la descripció de les fonts utilitzades, entre les que destaquen els llibres de comptes dels pabordes, i on queda prou palesa la importància del fet d'haver pogut disposar d'una excepcional font seriada, a més a més de pergamins. El tercer correspon a l'estudi de la institució tractada, que tenia terres a les actuals comarques del Gironès, La Selva, l'Alt i el Baix Empordà i el Pla de l'Estany. En el quart capítol hi analitzo els problemes generats a l'hora d' intentar conèixer el nombre de persones que eren pròpies de l'Almoina i saber de quins masos provenien. A continuació segueixen els quatre capítols que constitueixen el cos central de la tesi. Al seu torn, la seva anàlisi va ocasionar l'elaboració dels tres darrers. En el capítol cinquè s'estudien tots els homenatges rebuts per l'Almoina entre els anys 1300 i 1457, tant els que figuren en els manuals de comptes com els conservats en pergamí. En total, tenim documentats 1258 dels homenatges o reconeixements de domini rebuts per la institució. El capítol següent és dedicat a l'estudi de les firmes d'espoli forçades i als 424 cobraments fets per l'Almoina per aquest concepte, entre els anys 1331 i 1452. En els capítols setè i vuitè, s'analitzen els mals usos que gravaven les sortides del domini, tant les voluntàries com les involuntàries. El resultat obtingut és que entre 1331 i 1458, la institució va concedir la llibertat a 557 persones bona part de les quals van tornar a adscriure's de nou a una altra senyoria. El nombre d'aquests sortides contrasta amb el cobrament per part de l'Almoina, entre aquestes mateixes dates, de només 105 intèsties i eixòrquies; dit d'una altra manera, fins l'any 1445 va ingressar diners en concepte de 23 intèsties, fins el 1458 per 68 eixòrquies i fins el 1406 per 14 intèsties i/o eixòrquies. Els capítols 9 i 10 tracten del significat i les limitacions que comportaven els mals usos, com a trets definitoris de la pertinença a la servitud, sobre les persones que hi estaven sotmeses. Finalment, el darrer capítol analitza el compliment de la sentència dictada pel rei Alfons el Magnànim l'any 1457 en la que suspenia la servitud al Principat de Catalunya. Queda fora de dubte que pocs anys abans de la primera guerra remença els homenatges i els mals usos havien deixat d'aplicar-se.